目前,常用的****方法(fa)多采(cai)用物理方法(fa)(如干熱(re)**法(fa)、濕熱(re)**法(fa)、過濾**法(fa)、射線**法(fa)等)和(he)化學(xue)方法(fa)(**劑(ji)、***)兩大類。
1.干熱**法
是利用(yong)(yong)恒(heng)溫干燥箱內(nei)160℃~170℃的(de)高熱(re),并(bing)保持90~120分鐘,殺死**和芽孢,達到(dao)**目的(de)的(de)一種方法(fa)。主要適用(yong)(yong)于不便在(zai)(zai)壓力蒸(zheng)汽**器中(zhong)進行**,且不易被高溫損壞(huai)的(de)玻璃器皿(min)、金屬(shu)器械(xie)以及不能和蒸(zheng)汽接觸(chu)的(de)物(wu)品的(de)**。用(yong)(yong)此方法(fa)**的(de)物(wu)品干燥,易于貯存(cun)。酒精燈(deng)火(huo)焰燒灼**法(fa)也是屬(shu)于干熱(re)**的(de)方法(fa)之(zhi)一,在(zai)(zai)進行微生物(wu)檢測(ce)工(gong)(gong)作時,常(chang)須利用(yong)(yong)工(gong)(gong)作臺面上(shang)的(de)酒精燈(deng)火(huo)焰對金屬(shu)器具(ju)及玻璃器皿(min)口(kou)緣進行補充(chong)**。
2.濕熱**法
壓(ya)力(li)蒸汽(qi)濕熱(re)**法是目前*常用(yong)的一種**方法。它(ta)利用(yong)高壓(ya)蒸汽(qi)以及在(zai)(zai)蒸汽(qi)環(huan)境中存在(zai)(zai)的潛熱(re)作(zuo)(zuo)用(yong)和(he)良好的穿透力(li),使菌體(ti)蛋白質凝(ning)固變性而使微生物死亡。適合于布類工(gong)作(zuo)(zuo)衣、各種器皿(min)、金屬(shu)器械(xie)、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和(he)培養基的**。高壓(ya)蒸汽(qi)**器的蒸汽(qi)壓(ya)力(li)一般調整為0.10-0.11MPa,維(wei)持20~30min即(ji)可達到**效(xiao)果。
3.射線**法
利(li)用(yong)(yong)紫(zi)外(wai)(wai)線(xian)(xian)(xian)燈進(jin)行(xing)照射**的方法(fa)。紫(zi)外(wai)(wai)線(xian)(xian)(xian)是一種低能量的電磁輻(fu)射,可以殺滅(mie)多種微生(sheng)物(wu)(wu)。紫(zi)外(wai)(wai)線(xian)(xian)(xian)的作用(yong)(yong)機(ji)制是通過對(dui)微生(sheng)物(wu)(wu)的核酸及蛋(dan)白(bai)質等(deng)(deng)的破壞(huai)作用(yong)(yong)而(er)使(shi)其滅(mie)活。適合于實(shi)驗室空氣、地面、操(cao)作臺(tai)面**。**時間為30min。用(yong)(yong)紫(zi)外(wai)(wai)線(xian)(xian)(xian)**時應注(zhu)意,不能邊照射邊進(jin)行(xing)實(shi)驗操(cao)作,因為紫(zi)外(wai)(wai)線(xian)(xian)(xian)不僅對(dui)人體(ti)皮膚有傷害,而(er)且(qie)對(dui)培(pei)養物(wu)(wu)及一些(xie)試劑等(deng)(deng)也會(hui)產生(sheng)**影響(xiang)。
4.過濾**法
是將(jiang)液體或氣體通(tong)過有微孔的濾(lv)(lv)膜過濾(lv)(lv),使大于濾(lv)(lv)膜孔徑的**等微生(sheng)物(wu)顆粒阻留,從(cong)而(er)達到(dao)**的方法。過濾(lv)(lv)**法大多用于遇熱易發生(sheng)分解、變性而(er)失效的試劑、酶液、血清、培養(yang)基等。
目前,常用微孔(kong)濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)金(jin)屬濾(lv)(lv)(lv)器(qi)或塑料濾(lv)(lv)(lv)器(qi)正壓(ya)(ya)過(guo)濾(lv)(lv)(lv)**,或用玻璃**濾(lv)(lv)(lv)器(qi)、濾(lv)(lv)(lv)球負壓(ya)(ya)過(guo)濾(lv)(lv)(lv)**。濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)孔(kong)徑應在0.22~0.45μm范圍內(nei)或用更(geng)小的(de)(de)**濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo),溶液通過(guo)濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)后,**和孢子(zi)等因(yin)大(da)于濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)孔(kong)徑而被阻(zu),并利用濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)的(de)(de)吸附作(zuo)用,阻(zu)制小于濾(lv)(lv)(lv)膜(mo)(mo)(mo)(mo)孔(kong)徑的(de)(de)**透過(guo)。
5.化學**劑(ji)**法
用(yong)于(yu)那些不能(neng)利(li)用(yong)物理方法進行**的(de)(de)物品、空氣、工作面(mian)、操作者皮膚、某些實驗(yan)器皿等。常(chang)用(yong)的(de)(de)化(hua)學(xue)**劑(ji)包括甲醛(quan)、高(gao)(gao)錳酸鉀、70%~75%乙(yi)醇、過(guo)氧乙(yi)酸、來(lai)蘇爾(er)水(shui)、0.1%新潔爾(er)滅(mie)、環氧乙(yi)烷(wan)、碘伏(fu)或碘酊等。其中利(li)用(yong)70%~75%乙(yi)醇、0.1%~0.2%氯(lv)化(hua)汞、10%次氯(lv)酸鈉、飽和(he)(he)漂白粉(fen)等進行實驗(yan)材料的(de)(de)**;利(li)用(yong)甲醛(quan)加高(gao)(gao)錳酸鉀[(2mL甲醛(quan)+1g高(gao)(gao)錳酸鉀)/m3]或乙(yi)二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸(zheng)法進行無菌室(shi)和(he)(he)培(pei)養室(shi)的(de)(de)**。在使用(yong)時(shi)(shi)應注(zhu)意(yi)**,特別是用(yong)在皮膚或實驗(yan)材料上的(de)(de)**劑(ji),須選用(yong)合適的(de)(de)藥(yao)劑(ji)種類、濃度和(he)(he)處理時(shi)(shi)間,才能(neng)達到**和(he)(he)**的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。
6.***抑菌法(fa)
主要(yao)(yao)用于培(pei)(pei)養(yang)基,是培(pei)(pei)養(yang)過程中預防微(wei)生(sheng)物污(wu)染的重要(yao)(yao)手段以及(ji)作為微(wei)生(sheng)物污(wu)染不(bu)嚴重時的“急救”措施。常用的***有青霉(mei)素、鏈霉(mei)素和新霉(mei)素等。
二、不同種(zhong)類物品及培養物的****方法
1.無菌操作室**
由于無(wu)菌操(cao)作(zuo)室(shi)的污染來(lai)源主要(yao)是空氣(qi)中的**和**孢子,因此長期停(ting)用(yong)(yong)后(hou)的無(wu)菌操(cao)作(zuo)室(shi)應進(jin)(jin)行(xing)(xing)熏蒸**,熏蒸是用(yong)(yong)高錳酸鉀(jia)+甲(jia)醛(quan)[(2mL甲(jia)醛(quan)+1g高錳酸鉀(jia))/m3]進(jin)(jin)行(xing)(xing)無(wu)菌室(shi)的**。經常使用(yong)(yong)的無(wu)菌操(cao)作(zuo)室(shi),在每(mei)次(ci)使用(yong)(yong)前(qian)都應進(jin)(jin)行(xing)(xing)地面(mian)衛(wei)生清潔,并用(yong)(yong)紫外(wai)線(xian)燈(deng)照射30min,進(jin)(jin)行(xing)(xing)空氣(qi)**。對超凈工作(zuo)臺(tai),每(mei)次(ci)操(cao)作(zuo)前(qian)用(yong)(yong)紫外(wai)燈(deng)照射30min,然后(hou)用(yong)(yong)70%~75%酒精(jing)擦(ca)拭。
2.培養液**
培(pei)養液(ye)在制備過程中帶有(you)各種(zhong)雜菌,分(fen)裝(zhuang)(zhuang)后應立即**,至少也應在4小時內(nei)完成**工序。目(mu)前常用(yong)過濾**法(fa)除去(qu)培(pei)養物(wu)操(cao)作液(ye)和培(pei)養液(ye)中的**。或對培(pei)養液(ye)中耐熱組分(fen)先進(jin)行(xing)高壓(ya)蒸汽**,然后在無菌室加入(ru)經過過濾**的不耐熱溶液(ye),混勻后分(fen)裝(zhuang)(zhuang)備用(yong)。
使用高壓(ya)蒸(zheng)汽(qi)**器(qi)**時(shi),將分裝好(hao)的培(pei)養液放(fang)入底部(bu)(bu)有一定量(liang)(淹(yan)沒加熱管)涼水(shui)的高壓(ya)蒸(zheng)汽(qi)**器(qi)內(nei),增(zeng)壓(ya)至0.035~0.040 MPa時(shi)排凈**器(qi)內(nei)冷空(kong)氣(qi),以便使蒸(zheng)汽(qi)能到達(da)各個**部(bu)(bu)位(wei),保證****徹底。然后繼續加壓(ya)加熱,當壓(ya)力表讀數達(da)到0.10~0.11MPa為121℃,保持15~20min即可。由于****效果取決于溫度而(er)不是壓(ya)力,所以在一定壓(ya)力下保持較長(chang)的****時(shi)間是必須(xu)的。
在121℃的(de)(de)(de)蒸汽(qi)溫(wen)度下可以很快殺死各(ge)種**及高(gao)度耐熱(re)的(de)(de)(de)芽(ya)孢桿菌,因此許多培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)的(de)(de)(de)****壓力、溫(wen)度一般保持(chi)在0.10~0.11MPa、121℃。****時(shi)(shi)(shi)間與需(xu)要****的(de)(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)量(liang)密切相(xiang)關(guan)(guan)(表1),時(shi)(shi)(shi)間不(bu)(bu)足達不(bu)(bu)到(dao)**效果,時(shi)(shi)(shi)間過(guo)(guo)(guo)長培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)內(nei)的(de)(de)(de)一些化(hua)學物質遭到(dao)破(po)壞,影響培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)成(cheng)分(fen)。****結束(shu)后(hou),關(guan)(guan)閉(bi)熱(re)源,只(zhi)有(you)當**器內(nei)壓力降(jiang)為零(ling)時(shi)(shi)(shi)才能打(da)開放(fang)氣閥,排(pai)除(chu)剩余蒸汽(qi),取(qu)出(chu)培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)。不(bu)(bu)可在壓力較高(gao)時(shi)(shi)(shi)打(da)開放(fang)氣閥,引起減壓沸騰,使容器中液(ye)(ye)體溢出(chu)。培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)組(zu)成(cheng)中如含(han)有(you)遇熱(re)易(yi)分(fen)解的(de)(de)(de)物質,則需(xu)用過(guo)(guo)(guo)濾方法****。首先對培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)中耐熱(re)組(zu)分(fen)進(jin)行高(gao)壓蒸汽(qi)**后(hou)放(fang)置(zhi)在無菌場所,固體培(pei)(pei)養(yang)(yang)液(ye)(ye)在40℃左右瓊脂(zhi)即將凝(ning)結前,加入經過(guo)(guo)(guo)過(guo)(guo)(guo)濾**的(de)(de)(de)不(bu)(bu)耐熱(re)溶液(ye)(ye),混勻后(hou)冷卻備(bei)用。
3.玻璃器皿、塑料器皿和器械**
玻璃器皿可進行(xing)(xing)干熱(re)**或高壓蒸汽**,但(dan)在蒸汽**后(hou)*好(hao)及時烘干水分(fen)。對不(bu)能進行(xing)(xing)高壓蒸汽**的塑料器皿可用75%酒(jiu)精浸泡,使用前在無菌(jun)(jun)操作臺面(mian)上(shang)晾干的同時,用紫外線重復**。實驗室還可以用環氧乙烷**袋對塑料器皿進行(xing)(xing)**,**后(hou)的器皿要充分(fen)散氣2~4小(xiao)時后(hou)才(cai)可使用。無菌(jun)(jun)操作所用的各種器械,一般采用干熱(re)或高壓蒸汽**,或用75%酒(jiu)精浸泡,然后(hou)在無菌(jun)(jun)操作臺面(mian)上(shang)晾干的同時再(zai)用紫外線重復**;在使用期(qi)間可多(duo)次對其(qi)進行(xing)(xing)酒(jiu)精燈火焰灼燒**。
4.培養(yang)材料的****
采自動物機(ji)體的(de)實驗材料(liao)(liao),攜帶著(zhu)微(wei)生物及雜質,接種前(qian)須(xu)進行表(biao)(biao)面(mian)****,對內(nei)部已受微(wei)生物侵染的(de)材料(liao)(liao)應予以淘汰。從動物機(ji)體采集的(de)某些組織塊,須(xu)用(yong)**劑進行浸泡處(chu)理(li),進行表(biao)(biao)面(mian)**。常用(yong)**劑有過氧化(hua)氫(10~12%,浸泡5~15 min)、過氧乙酸(suan)(0.05%,浸泡30s~1min)、酒精(70~75%,浸泡2 min)。
撰寫驗證方案及制(zhi)定評估標(biao)準。
確認**設備技術資料齊(qi)全、安(an)裝正(zheng)確,并能(neng)處于正(zheng)常運行。
確認關鍵設備控制儀表在規定的參數范圍內能正常(chang)運行(xing)。
采用(yong)被**物(wu)(wu)品(pin)或(huo)模(mo)擬物(wu)(wu)品(pin)進行(xing)重(zhong)復實驗確認**效(xiao)果符合規(gui)定(ding)。
完(wan)善文件記錄(lu),撰寫驗證報告。
關(guan)鍵參數應在(zai)驗(yan)證(zheng)確(que)定的范圍內:溫(wen)度(du)(du)(du)、壓力、時(shi)間、濕度(du)(du)(du)、**氣(qi)體濃度(du)(du)(du)、輻照劑量等。
**程(cheng)序定(ding)期驗(yan)證,時效不超(chao)過半年。
**設備(bei)或程序(xu)發生(sheng)變更重新(xin)進(jin)行驗證。
**效果與**前(qian)產品污(wu)(wu)染(ran)程度及污(wu)(wu)染(ran)菌特性有關,把握微生物污(wu)(wu)染(ran)水平(ping)及污(wu)(wu)染(ran)菌耐(nai)受(shou)性,注意各個環節降低污(wu)(wu)染(ran)程度。
**冷卻(que)階段防(fang)止(zhi)已**物品再次(ci)污染。
適用生物指(zhi)示劑(ji)、化(hua)學指(zhi)示劑(ji)等(deng)監控**結(jie)果。
基本要求:
菌(jun)種的(de)耐受性應大于(yu)需**產品中所有可(ke)能污染菌(jun)的(de)耐受性。
菌種應無致(zhi)病性(xing)。
菌株應(ying)穩定,存活(huo)期長,易于保存。
易于培養。若(ruo)使用休眠孢子,孢子含量(liang)在90%以上。
濕熱**:嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子(zi)(ATCC7953等,活孢子(zi)數(shu)為(wei)5×105~5×106個/片)。
干熱**:枯草芽孢(bao)桿菌孢(bao)子(ATCC9372等,活(huo)孢(bao)子數為(wei)5×105~5×106個/片)。
輻射**:短小芽孢(bao)桿菌(jun)孢(bao)子(ATCC27142等,活孢(bao)子數為5×107~5×108個(ge)/片)。
高(gao)壓蒸汽**法(fa):用高(gao)溫加(jia)高(gao)壓**,不僅可殺死一般的(de)**,對(dui)**芽(ya)胞也有殺滅(mie)效果,是*可靠(kao)、應用*普遍(bian)的(de)物理**法(fa)。主要用于能耐(nai)高(gao)溫的(de)物品(pin),如金屬(shu)器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡(xiang)膠及(ji)一些**和部分培養基的(de)**。